Magíster en Ciencias Biológicas

Preeclampsia (PE) es un síndrome hipertensivo del embarazo humano que se presenta después de las 20 semanas de gestación, y que se caracteriza por disfunción placentaria. Entre 6.2-7.4% de mujeres fallecen por complicaciones cerebrovasculares asociadas a PE como eclampsia, isquemia o hemorragia intracerebral. Además, cursan con disrupción de la barrera hematoencefálica (BHE), y edema cerebral vasogénico. La fisiopatología de estas complicaciones cerebrovasculares es desconocida. En este trabajo de tesis, hipotetizamos que vesículas extracelulares pequeñas (sEVs) provenientes de placentas hipóxicas son capaces de dañar la BHE, por un mecanismo que involucra reducción de la cantidad de claudina 5 (CLDN5). Esta última, es una proteína de unión estrecha entre células endoteliales, primordial para la estabilización en la función de la BHE. Para ello, se aislaron las sEVs desde explantes placentarios de embarazos normales, cultivados en normoxia (sEVs-Nor, 8% O2) o hipoxia (sEVs-Hyp, 1% O2) durante 18 horas, y se inyectaron a ratonas C57BL/6 no preñadas, para evaluar compromiso neurológico mediante escala rápida de coma y comportamiento murino (RMCBS), así como también análisis de disrupción de la BHE mediante ensayo con Evans blue (EB) sectorial. Además, se analizaron los efectos in vitro mediante evaluación de parámetros de BHE como resistencia eléctrica transendotelial (TEER) y permeabilidad celular a dextrano 70 kDa. Adicionalmente, se cuantificó la cantidad de CLDN5 tanto en cultivos celulares de endotelio cerebral de ratón y humano, como en tejido cerebral del modelo in vivo. Como resultados, se obtuvo que la inyección de sEVs-Hyp generan déficit neurológico en las ratonas desde las 3 horas, el cual es progresivo hasta las 24 horas post inyección. En estos animales, se evidenció una disrupción de la BHE mediante la cuantificación de extravasación de EB, principalmente en el área posterior del cerebro. Extravasación que concuerda con el modelo quirúrgico de preeclampsia caracterizado por la reducción de la perfusión uterina (RUPP). Las sEVs-Hyp tienen un alto contenido del factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF), lo cual se asocia con incremento del nivel de este factor detectado en suero de los animales inyectados con sEVs-Hyp. En forma importante, la inyección de sEVs-Hyp no genera cambios en los niveles de citoquinas pro-inflamatorias en el suero a las 6 horas post-inyección. Además, en el modelo in vitro, encontramos que las sEVs son incorporadas rápidamente (30 minutos) en las células endoteliales cerebrales. Asociado a ello, se evidencia que las sEVs-Hyp disminuyen la TEER y aumentan la permeabilidad a dextrano 70 kDa. Estos resultados asociados con una disminución en los niveles de CLDN5 a las 6 horas post exposición a sEVs-Hyp. En experimentos paralelos, y como una aproximación traslacional, encontramos que sEVs provenientes de plasma de mujeres con PE también dañan la BHE in vitro, y reducen la expresión de CLND5, en la membrana de células endoteliales cerebrales humanas. Este efecto, requirió de la presencia integra de las sEVs. En conclusión, las sEVs-Hyp dañan la BHE tanto en modelos in vitro como in vivo, siendo esta disrupción de manera específica, en la zona posterior del cerebro. Además, este daño de la BHE se asocia con disminución en los niveles de proteína CLDN5. El mecanismo implicaría un aumento en el nivel de VEGF circulante, que pudiera dañar la BHE.

Antecedentes: Adenosina es un nucleósido derivado del metabolismo del adenosin tri-fosfato que cumple múltiples funciones en el organismo, incluyendo control de la función y formación de vasos sanguíneos. Esta molécula actúa sobre una familia de receptores denominados A1, A2A, A2B y A3. Particularmente, el receptor A2A, tiene un rol estimulatorio de la formación de vasos sanguíneos (o angiogénesis), a través de la estimulación de proliferación, migración y maduración de células endoteliales. La importancia de este receptor en angiogénesis ha sido mostrada utilizando animales deficientes en el mismo, los cuales presentan una reducción en la capacidad angiogénica. Por otro lado, se conoce que hembras de distintas especies tienen una mayor capacidad angiogénica respecto a los machos. En el presente estudio proponemos que la deficiencia del receptor A2A de adenosina se asocia a menor capacidad angiogénica, la cual es más evidente en machos que en hembras. Objetivo: Determinar el papel del receptor de adenosina A2A como modulador del angiogénesis en ratones machos y hembras. Metodología: El presente estudio de tipo experimental, incluye dos modelos de estudio, uno in vitro y otro in vivo. Para el modelo in vitro, se aislaron cultivos primarios de células endoteliales de pulmón de animales controles o deficientes en el receptor A2A de adenosina (A2AAR-KO). Luego de la caracterización del cultivo primario mediante inmunoselección con CD31, las células fueron utilizadas para ensayos de western blot para determinar la presencia de los marcadores endoteliales CD34 y el receptor 2 del factor de crecimiento de endotelio vascular (KDR). Posteriormente, las células fueron utilizadas para extracción de RNA para determinar los niveles de RNA mensajero para los receptores A1, A2B y A3. Así como también se utilizaron las células para ensayos de proliferación, migración y capacidad de formación de tubos (angiogénesis in vitro) en ausencia o presencia de los agonistas no selectivos de los receptores de adenosina, NECA; o del agonista selectivo para el receptor A2A, CGS-21680. Todos los experimentos fueron realizados considerando el sexo de los animales desde los cuales fueron extraídas las células. Para los experimentos in vivo, animales control o A2AAR-KO fueron utilizados para ensayos de cicatrización de herida provocada en la zona dorsal del animal. Se realizó un seguimiento hasta los 10 días post-herida. En el día 4 post-herida se obtuvieron muestras de piel, las cuales fueron utilizadas para análisis histológico utilizado tinción de hematoxilina y eosina. Se realizó además análisis del flujo sanguíneo mediante laser Doppler. Resultados: Se encontró que las células CD31 positivas, mostraron un aumento significativo de KDR o de CD34 respecto a aquellas células no expuestas a selección por CD31 tanto en células de animales control como de A2AAR-KO. En hembras se encontró un aumento significativo en los niveles relativos de mRNA para el receptor A2B (1.8 veces, p<0.05) y el receptor A3 (2.7 veces, p<0.05) en A2AAR-KO respecto a su respectivo control (WT); mientras que en el receptor A1 no se evidencia cambios en los niveles relativos de mRNA en ambos grupos. Por otra parte, en machos se observó un aumento significativo en los niveles relativos de mRNA para los receptores A1 (2.1 veces, p<0.05) respecto a sus respectivos controles (WT). En el ensayo de proliferación celular se encontró que las hembras control mostraban una mayor sensibilidad al agonista no selectivo NECA que las hembras A2AAR-KO, o que los ratones machos control o A2AAR-KO, en al menos un orden de magnitud. No se observan cambios significativos en la logEC50 (10-6.4 M, 95%CI 10-7.39 a 10-5.54 M versus 10-6.1 M, 95%CI 10-6.59 a 10-5.65 M, respectivamente) entre células de hembras o machos control. Únicamente, las células endoteliales de animales control, hembras y machos, presentaron respuesta proliferativa mediada por CGS-21680. Además, en hembras control se mostró que tanto NECA como CGS-21680 incrementaron significativamente la migración celular respecto a la condición basal; situación que no se observó en su contraparte A2AAR-KO. Es más, en este último grupo, la respuesta a CGS-21680 fue significativamente menor que la observada en los ratones control. Para el caso de los machos, se encontró que únicamente CGS-21680 fue capaz de provocar un aumento significativo (1.3 veces, P<0.05) en la migración celular en ratones control. En ratones A2AAR-KO, ni NECA o CGS-21680 generaron cambios significativos respecto a la condición basal. Sin embargo, a diferencia de lo observado en hembras, los machos A2AAR-KO tuvieron una menor respuesta migratoria en todas las condiciones experimentales. Respecto a los ensayos de diferenciación endotelio o angiogénesis in vitro, mosque que las células de hembras o machos control incrementaron significativamente en presencia de NECA o CGS-21680, un efecto que no fue observado en células de ratones A2AAR-KO. Los resultados in vivo mostraron que los machos A2AAR-KO tuvieron una herida más grande que sus respectivos controles (0.63  0.09 vs 0.27  0.01 mm, respectivamente, P=0.05). Mientras que, en hembras, las diferencias no fueron estadísticamente significativas entre ratones A2AAR-KO y sus controles a los 10 días de seguimiento. Además, se encontró que los machos A2AAR-KO tuvieron una dermis más gruesa (1.3 veces, P<0.05), pero una epidermis más delgada (-15%) que las hembras A2AAR-KO. Finalmente, los resultados muestran que el flujo sanguíneo fue mayor en los animales A2AAR-KO en hembras y machos, siendo en estos últimos estadísticamente significativo respecto a su respectivo control (P=0.01). De forma interesante, los resultados también muestran que el flujo sanguíneo en hembras A2AAR-KO fue constante, similar a lo encontrado en ratones hembra control. Sin embargo, en el ratón macho A2AAR-KO el flujo fue intermitente mostrando una amplia variabilidad en las mediciones. Conclusión: La condición genotípica de deficiencia del receptor A2A de adenosina genera una adaptación pro angiogénica tanto en hembras como en machos, dándoles una ventaja a las hembras respecto a los machos, tanto en ensayos in vitro (migración y diferenciación endotelial (tubos) como la respuesta in vivo (cicatrización y fluyo sanguíneo).

Antecedentes: Estudios farmacológicos sugieren que la activación del receptor de adenosina A2A (A2AAR) vía generación de óxido nítrico (NO) aumenta la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) provenientes de embarazos normales o con pre-eclampsia. Por otro lado, el factor inducido por hipoxia 1 alfa (HIF-1α) regula la expresión de VEGF y además es sensible a cambios en los niveles de NO intracelular. Objetivos: Comprobar si la presencia funcional del A2AAR es necesaria para regular expresión de VEGF en células provenientes de embarazos normales y pre-eclámpticos; e, investigar si el aumento de la expresión de VEGF mediada por A2AAR involucra la participación de HIF-1α. Metodología: Cultivos primarios de HUVEC, así como de células endoteliales de la microcirculación placentaria (hPMEC) de embarazos normales (n=10) y pre-eclámpticos (n=8) fueron utilizados en este estudio. Además, en experimentos puntuales de hipoxia (i.e., 2% oxígeno, como modelo de pre-eclampsia) se utilizó una línea celular de HUVEC. Las células fueron incubadas (12 o 24 h) con el agonista selectivo del A2AAR, CGS-21680 (10-8M) en ensayos de pérdida y ganancia de la expresión funcional del A2AAR, para posteriormente medir los niveles de mRNA de VEGF por PCR semicuantitativo, proliferación celular y ensayos de angiogénesis en matrigel. En experimentos paralelos, el donador de óxido nítrico, SNAP (10-9M) fue co-incubado con CGS-21680 en ensayos de represión de la expresión de A2AAR. Estudios de translocación de HIF-1α fueron realizados en células expuestas a CGS-21680, utilizando histona 3 como marcador de extracción nuclear. Resultados: La estimulación con CGS-21680 (24 h) aumenta la proliferación celular en forma dosis respuesta (LogEC50 10-9.6 M), la cual fue inhibida por su antagonista selectivo SCH-58261. Además, similar a CGS-21680, SNAP aumentó la proliferación celular en forma dosis respuesta (LogEC50 10-9.2 M). Posteriormente, HUVEC expuestas a un RNA de interferencia (siRNA) para A2AAR, mostraron una reducción en el nivel de mRNA (94%) y de proteína (83%) para A2AAR respecto a la condición control sin siRNA; lo cual se asoció a una significativa reducción en la respuesta a CGS-21680, estimada por los niveles de AMP cíclico intracelular (AMPc), y nitritos, (i.e., metabolitos NO), así como por una reducida capacidad de formación de tubos en matrigel, sin afectar la sobrevida celular. En estas condiciones experimentales, se encontró que el donador de NO, SNAP, recuperó parcialmente la proliferación celular y la capacidad de formación de tubos de las células provenientes de embarazos normales expuestas a siRNA para A2AAR. En otra serie de experimentos se encontró que CGS-21680 incrementoo significativamente (~1.5 veces) el nivel de mRNA para VEGF en células de embarazos normales, pero no así, en HUVEC de pre-eclampsia. Adicionalmente, en comparación con células no transfectadas, la transfección con 2 siRNA para A2AAR generó una disminución (~30%) del nivel de mRNA para VEGF en embarazo normal y preeclampsia, un efecto que fue revertido mediante la co-incubación con SNAP, únicamente en células de embarazos normales. Por otro lado, en una línea celular de HUVEC en la cual se realizaron ensayos de ganancia y pérdida de expresión del A2AAR mediante la utilización del vector CVM-flag A2A y del siRNA A2A, respectivamente; se encontró que CGS-21680 no fue capaz de aumentar significativamente los niveles de mRNA para VEGF tanto en condición normoxia como hipoxia. Sin embargo, la represión del A2AAR redujo significativamente (32%) los niveles de mRNA para VEGF en condición normoxia; no así en hipoxia, en donde hubo una reducción parcial del 18% en relación al control. Paradójicamente, la sobre-expresión del A2AAR también redujo el nivel de VEGF tanto en normoxia (62%, p<0.05) como en hipoxia (56%, p=NS). Además, se mostró la presencia de la vía A2A-NO-VEGF en hPMEC de embarazos normales y pre-eclámpticos. Así, en estas células, CGS-21680 aumentó la proliferación celular en forma dosis respuestas mostrando una logEC50 de 10-8.7 M. CGS-21680 (10-8M x 12 h) aumentó el nivel de proteína VEGF tanto en células de embarazos normales (1.5 veces) como pre-eclámpticas (1.2 veces). Este aumento, fue bloqueado por el antagonista del A2AAR, ZM-241385 (10-5 M) y por el inhibidor de la síntesis de NO, L-NAME, en células de ambas condiciones estudiadas. Adicionalmente, ZM-241385 o L-NAME, en forma independiente, redujeron (40 y 80%, respectivamente) la abundancia de proteína VEGF en células de embarazos normales. Por su parte en pre-eclampsia, también se evidenció una reducción con estas dos moléculas alcanzando 50 y 15% de reducción, respectivamente, en relación a la condición basal sin tratamiento. Finalmente, los estudios de translocación mostraron que CGS-21680 indujo un aumento significativo en el nivel de proteína HIF-1α en la fase nuclear en células de embarazos normales, pero no en aquellas provenientes de pre-eclampsia. Conclusiones: La presencia de A2AAR es necesaria para inducir la expresión de VEGF, por una vía que involucraría óxido nítrico y translocación del HIF-1α al núcleo. La vía A2A-NO-VEGF estaría presente en forma transversal en endotelio de la micro y la macrocirculación ya sea de embarazos normales o pre-eclámpticos. Sin embargo, en HUVEC de pre-eclampsia, es posible que la señalización vía NO esté alterada. La sobre-expresión de A2AAR desencadena un efecto compensatorio de limitación de la expresión de VEGF.